描述:啟動子是DNA鏈上一段能與RNA聚合酶結(jié)合并起始RNA合成的序列,它是基因表達(dá)*的重要調(diào)控序列。沒有啟動子,基因就不能轉(zhuǎn)錄。由于細(xì)菌RNA聚合酶不能識別真核基因的啟動子,因此原核表達(dá)載體所用的啟動子必須是原核啟動子。
原核表達(dá)載體指:能攜帶插入的外源核酸序列進(jìn)入原核細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制的載體。
啟動子是DNA鏈上一段能與RNA聚合酶結(jié)合并起始RNA合成的序列,它是基因表達(dá)*的重要調(diào)控序列。沒有啟動子,基因就不能轉(zhuǎn)錄。由于細(xì)菌RNA聚合酶不能識別真核基因的啟動子,因此原核表達(dá)載體所用的啟動子必須是原核啟動子。 原核啟動子是由兩段彼此分開且又高度保守的核苷酸序列組成,對mRNA的合成極為重要。在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游5~10 bp處,有一段由6~8個堿基組成,富含A和T的區(qū)域,稱為Pribnow 盒,又名TATA 盒或-10區(qū)。來源不同的啟動子,Pribnow 盒的堿基順序稍有變化。在距轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游35 bp處,有一段由10 bp組成的區(qū)域,稱為-35區(qū)。轉(zhuǎn)錄時大腸桿菌RNA聚合酶識別并結(jié)合啟動子。-35區(qū)與RNA聚合酶s亞基結(jié)合,-10區(qū)與RNA聚合酶的核心酶結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近DNA被解旋形成單鏈,RNA聚合酶使*和第二核苷酸形成磷酸二酯鍵,以后在RNA聚合酶作用下向前推進(jìn),形成新生的RNA鏈。 原核表達(dá)系統(tǒng)中通常使用的可調(diào)控的啟動子有Lac(乳糖啟動子)、Trp(色氨酸啟動子)、Tac(乳糖和色氨酸的雜合啟動子) 、lPL (l噬菌體的左向啟動子)、T7噬菌體啟動子等。
1974年Shine和Dalgarno首先發(fā)現(xiàn),在mRNA上有核糖體的結(jié)合位點(diǎn),它們是起始密碼子AUG和一段位于AUG上游3~10 bp處的由3~9 bp組成的序列。這段序列富含嘌呤核苷酸,剛好與16S rRNA 3¢末端的富含嘧啶的序列互補(bǔ),是核糖體RNA的識別與結(jié)合位點(diǎn)。以后將此序列命名為Shine-Dalgarno序列,簡稱SD序列。它與起始密碼子AUG之間的距離是影響mRNA轉(zhuǎn)錄、翻譯成蛋白的重要因素之一,某些蛋白質(zhì)與SD序列結(jié)合也會影響mRNA與核糖體的結(jié)合,從而影響蛋白質(zhì)的翻譯。另外,真核基因的第二個密碼子必須緊接在ATG之后,才能產(chǎn)生一個完整的蛋白質(zhì)。
在一個基因的3¢末端或是一個操縱子的3'末端往往有特定的核苷酸序列,且具有終止轉(zhuǎn)錄功能,這一序列稱之為轉(zhuǎn)錄終止子,簡稱終止子(terminator)。轉(zhuǎn)錄終止過程包括:RNA聚合酶停在DNA模板上不再前進(jìn),RNA的延伸也停止在終止信號上,完成轉(zhuǎn)錄的RNA從RNA聚合酶上釋放出來。對RNA聚合酶起強(qiáng)終止作用的終止子在結(jié)構(gòu)上有一些共同的特點(diǎn),即有一段富含A/T的區(qū)域和一段富含G/C的區(qū)域,G/C富含區(qū)域又具有回文對稱結(jié)構(gòu)。這段終止子轉(zhuǎn)錄后形成的RNA具有莖環(huán)結(jié)構(gòu),并且有與A/T富含區(qū)對應(yīng)的一串U。轉(zhuǎn)錄終止的機(jī)制較為復(fù)雜,并且結(jié)論尚不統(tǒng)一。但在構(gòu)建表達(dá)載體時,為了穩(wěn)定載體系統(tǒng),防止克隆的外源基因表達(dá)干擾載體的穩(wěn)定性,一般都在多克隆位點(diǎn)的下游插入一段很強(qiáng)的rrB核糖體RNA的轉(zhuǎn)錄終止子。
?。?)通過PCR方法:以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板,按基因序列設(shè)計(jì)一對引物(在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點(diǎn)),PCR循環(huán)獲得所需基因片段。
(2)通過RT-PCR方法:提取總RNA,以mRNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA*鏈,以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。
(1)載體酶切:將表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶(同引物的酶切位點(diǎn))進(jìn)行雙酶切,酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后,用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。
?。?)PCR產(chǎn)物雙酶切后回收,在T4DNA連接酶作用下連接入載體。
?。?) 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,根據(jù)重組載體的標(biāo)志(抗Amp或藍(lán)白斑)作篩選,挑取單斑,堿裂解法小量抽提質(zhì)粒,雙酶切初步鑒定。
?。?)測序驗(yàn)證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進(jìn)入下步操作。否則應(yīng)篩選更多克隆,重復(fù)亞克隆或亞克隆至不同酶切位點(diǎn)。
?。?) 以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞。
1. pET系列載體 | ||
1. pET系列載體 | ||
78-pet-5a | pET-5a | 2ug |
78-pet11a | pET11a | 2ug |
78-pet-11b | pET-11b | 2ug |
78-pet-11c | pET-11c | 2ug |
78-pet-15b | pET-15b | 2ug |
78-pet-16b(+) | pET-16b(+) | 2ug |
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78-pet-20b(+) | pET-20b(+) | 2ug |
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78-pet-22b | pET-22b | 2ug |
78-pet-23a(+) | pET-23a(+) | 2ug |
78-pet-24 | pET-24 | 2ug |
78-pet24a(+) | pET24a(+) | 2ug |
78-pet24-b | pET24-b | 2ug |
78-pet-25b(+) | pET-25b(+) | 2ug |
78-pet26b | pET26b | 2ug |
78-pet27-b | pET27-b | 2ug |
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78-pet-28b | pET-28b | 2ug |
78-pet-28c | pET-28c | 2ug |
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78-pet-30a | pET-30a | 2ug |
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78-pet-30c | pET-30c | 2ug |
78-pet-32a | pET-32a | 2ug |
78-pet32(+)c | pET32(+)c | 2ug |
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78-pet38b(+) | pET38b(+) | 2ug |
78-pet-39b | pET-39b | 2ug |
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78-pet-40b(+) | pET-40b(+) | 2ug |
78-pet-41a | pET-41a | 2ug |
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78-pet-42b | pET-42b | 2ug |
78-pet-43a | pET-43a | 2ug |
78-pet-43b | pET-43b | 2ug |
78-pet-49b(+) | pET-49b(+) | 2ug |
78-PET-31b(+) | ET31b(+) | 2ug |
78-pet-41b(+) | pET-41b(+) | 2ug |
78-pet41Ek-Lic | pET41Ek-Lic | 2ug |
2. PTYB 系列載體 | 2. PTYB 系列載體 | |
78-TYB1 | TYB1 | 2ug |
78-TYB2 | TYB2 | 2ug |
78-TYB11 | TYB11 | 2ug |
78-TYB12 | TYB12 | 2ug |
3. pGEX系列載體 | 3. pGEX系列載體 | |
78-pGEX-4T-1 | pGEX-4T-1 | 2ug |
78-pGEX-4T-2 | pGEX-4T-2 | 2ug |
78-pGEX-6P-1 | pGEX-6P-1 | 2ug |
78-pGEX-20T | pGEX-20T | 2ug |
78-pGEX-4T-3 | pGEX-4T-3 | 2ug |
78-pGEX-6P-2 | pGEX-6P-2 | 2ug |
78-pGEX-5X-1 | pGEX-5X-1 | 2ug |
78-pGEX-2TK | pGEX-2TK | 2ug |
78-pGEX | pGEX | 2ug |
78-pGEX-KG | pGEX-KG | 2ug |
4. pBAD系列載體 | 4. pBAD系列載體 | |
78-pBAD24 | pBAD24 | 2ug |
78-pBAD43 | pBAD43 | 2ug |
78-pBADHis A | pBADHis A | 2ug |
78-pBADHisB | pBADHisB | 2ug |
78-pBADHisC | pBADHisC | 2ug |
5.原核融合表達(dá)載體 | 5.原核融合表達(dá)載體 | |
78-PProEX-HTa | pProEX-HTa | 2ug |
78-PProEX-HTb | pProEX-HTb | 2ug |
78-PProEX-HTc | pProEX-HTc | 2ug |
78-PMAL-c4x | pMAL-c4x | 2ug |
78-PEYFP-mem | pEYFP-mem | 2ug |
78-PEXP1-DEST | pEXP1-DEST | 2ug |
6. 其他載體 | ||
78-Pbv220 | pbv220 | 2ug |
78-PET-DsbA | pET-DsbA | 2ug |
78-PET-GST | pET-GST | 2ug |
78-PET-His | pET-His | 2ug |
78-KD3 | KD3 | 2ug |
78-PLLP-Om78-PA | pLLP-OmpA | 2ug |
78-PLLP-STII | pLLP-STII | 2ug |
78-PMAL-C2X | pMAL-C2X | 2ug |
78-PMAL-P2X | pMAL-P2X | 2ug |
78-PMBP-P | pMBP-P | 2ug |
78-PQE30 | pQE30 | 2ug |
78-PQE31 | pQE31 | 2ug |
78-PQE-32 | pQE-32 | 2ug |
78-PRSET C | pRSET C | 2ug |
78-PRSET-A/B | pRSET-A/B | 2ug |
78-PTH-304-18Z | pTH-304-18Z | 2ug |
78-PTrcHis B | pTrcHis B | 2ug |
78-PTrcHis C | pTrcHis C | 2ug |
78-PTrcHisA | pTrcHisA | 2ug |
78-PTrxFus | pTrxFus | 2ug |
78-PTWIN1 | pTWIN1 | 2ug |
78-PG-KJE8 | pG-KJE8 | 2ug |
78-PGro7 | pGro7 | 2ug |
78-PKJE7 | pKJE7 | 2ug |
78-PG-Tf2 | pG-Tf2 | 2ug |
78-PTf16 | pTf16 | 2ug |
78-PQE40 | pQE40 | 2ug |
78-PCMV-myc | pCMV-myc | 2ug |
78-PQE80 | pQE80 | 2ug |
78-PSE380 | pSE380 | 2ug |
78-PQE-9 | pQE-9 | 2ug |
78-PQE-60 | pQE-60 | 2ug |
78-PQE-70 | pQE-70 | 2ug |
78-PTWIN2 | pTWIN2 | 2ug |
78-PCFS119 | PCFS119 | 2ug |
78-PVSV-G | pVSV-G | 2ug |
78-PCDFDuet-1 | pCDFDuet-1 | 2ug |
78-PSecTag2 HygroA | pSecTag2 HygroA | 2ug |